在大脑这一复杂的器官中，神经胶质细胞扮演着至关重要的角色。包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞在内的神经胶质细胞，这些细胞不仅参与调节大脑的稳态功能、髓鞘形成及神经信号传递，还在神经损伤的响应中发挥了重要作用[1]。这些细胞功能的任何失调，都可能与发育性和神经退行性疾病的发病机制有关[2]。在大脑样本中，小胶质细胞通常仅占目标群体的10%不到，少突胶质细胞则约占目标群体的20%以上，而星形胶质细胞可占目标群体的17%至61%[3,4]。细胞分选可以帮助这些神经胶质研究，并加强从不同细胞群中纯化单个细胞类型，正如在大脑中发现的那样。
WOLF G2®Cell Sorter：精准捕捉神经胶质细胞
NanoCellect Biomedical, Inc. 推出的WOLF G2®Cell Sorter，为研究者提供了一种从新鲜和固定的小鼠脑组织中分离这些关键神经胶质细胞的高效方法。该技术的应用，不仅提高了样本处理的灵活性，还保证了细胞的高纯度和活性。本应用中采用锌固定法用于处理无法即时使用的脑组织，该方法可以有效的保持细胞结构和RNA的完整性[5,6]。
在将成年小鼠脑（C57BL/6, Crown Biosciences）放置在装有EBSS的冰盘中切割成小块，离心后去除上清液。随后加入含有HBSS、FBS、HEPES、Dispase II和DNase I的酶混合物中，37°C水浴中酶解。每5分钟搅拌20次避免组织粘附损失，15分钟后使用不同大小的枪头进行3次慢速抽打混匀。随后通过70 µm尼龙网过滤，并使用无钙和镁的HBSS、1% BSA和2 mM EDTA组成的低温分选缓冲液洗涤3次，离心5分钟。
用1 mL含镁和钙的10×HBSS稀释9 mL Percoll Plus制备等渗Percoll，然后用1×不含钙和镁的HBSS进一步稀释该等渗溶液，形成30% Percoll溶液。使用RBC缓冲液去除红细胞后，采用30% Percoll溶液进行重悬，离心后去除髓鞘。多余的分选缓冲液重悬颗粒离心后用低温分选缓冲液重悬样品进行细胞染色。
将快速冷冻的成年小鼠脑(Rockland, MS-T004)于1×锌缓冲液中4°C处理过夜。次日离心并洗涤后于冰上切碎，使用枪头抽打分散，然后通过70 µm网过滤，洗涤。用分选缓冲液重悬样品进行细胞染色。
新鲜细胞样本使用ASCA-2 PE、O4 APC和CD11b APC进行染色；固定细胞样本仅使用ASCA-2 PE染色，新鲜细胞和固定细胞在4°C黑暗中孵育30分钟，然后洗涤。洗涤后将样品稀释至终浓度为3.0×105个细胞/mL，在分析前通过40 µm细胞过滤器过滤两次，并在分选前使用DAPI进行活细胞染色。
使用WOLF G2®Cell Sorter，通过仪器红色激光配置（488/637 nm）及紫色激光配置（405/488 nm）分别对不同标记的细胞进行分选。此外，用7-AAD染色样品，在分选2小时后测量新鲜小鼠组织中星形胶质细胞分选后活力，并与预分选样品和由25%热灭活细胞及75%活细胞组成的对照样品进行比较。
1、在分选前，新鲜小鼠脑中星形胶质细胞的起始目标群为25.8%，小胶质细胞为15.6%，少突胶质细胞为40.7%。新鲜小鼠脑中分离的星形胶质细胞、小胶质细胞和少突胶质细胞分选后纯度分别达到了92.7%、95.7%和93.2%。固定小鼠脑组织中的星形胶质细胞经过分选后，纯度从58.2%富集到81.5%。
图1. 新鲜组织中星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和固定组织中星形胶质细胞的纯度：对小鼠组织进行两种不同的分选，其中从ASCA-2 PE和O4-APC染色的样品中分选星形胶质细胞和小胶质细胞。随后用ASCA-2 PE和CD11b-APC染色的样品进行第二次分类，对星形胶质细胞和少突胶质细胞进行分类。细胞分选后纯度大于90%。同时，固定脑组织的星形胶质细胞分选后纯度大于80%。
2、分选前，固定的脑组织样本在分选前可以观察到大量星形胶质细胞碎片（图2A）；分选后，碎片显著减少，留下的是大部分纯化的星形胶质细胞（图2B）。
图2. 用ASCA-2(红色)和DAPI(蓝色)染色细胞分选前后固定组织代表图：(A)在分选前对固定组织进行分析时，可观察到星形胶质细胞标记物能够染色碎片，这突出了添加DPAI-maker区分碎片和实际细胞的重要性。(B)细胞后分选显示碎片被分选耗尽，根据DAPI和ASCA-2的合并，分选的细胞以星形胶质细胞为主(紫色)。细胞在ECHO Revolve 上以4倍放大率成像。
3、与预分选样本相比，新鲜脑组织中分离的星形胶质细胞经分选后的活率保持不变，超过90%的细胞仍然存活。预分选细胞活率为92.5%，分选后提高到98.9%。活/死对照混合物的细胞活率为73.6%，这表明温和的分选过程有利于维持细胞活率。
图3. 星形胶质细胞的活率：7-AAD 被用作从新鲜脑组织中分离出的星形胶质细胞的活性染色剂。活性为对照样本以及分选前后活细胞的百分比，表明星形胶质细胞在分选后仍具有活性。
WOLF G2®Cell Sorter的应用，为神经科学研究提供了一个强大的工具，使得研究者能够从复杂的脑组织中高效地分离出目标细胞群体。无论是新鲜还是固定的样本，该技术都能够保证细胞的高纯度和活率从而获得更广泛的组织可用性，可为下游实验如单细胞测序等提供可靠的细胞来源。
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[2] Agalave NM, Lane BT, Mody PH, Szabo-Pardi TA, and Burton MD (2020) Isolation, culture, and downstream characterization of primary microglia and astrocytes from adult rodent brain and spinal cord. Journal of Neuroscience Methods. 340: 108742. https://doi.org/10.1016/j.jneumeth.2020.108742.
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[6] Abshair M, Adams D, Bergeron A, Brundage K, Clise-Dwyer K, Cochran M, Del Rio Guerra R, Holmes L, Lood N, Meyer M, Niziolek Z, Saluk A, and Thornton S (2019). A Multi-Core Study on How Different Fixation Methods Prior to Sorting Impact the Purity, Quality, and Yield of RNA From Sorted Cells. Poster presented at: ABRF 2019 – The Association of Biomolecular Resource Facilities; April 23, 2019; San Antonio, TX.
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