案例应用丨S.NEST微型生物反应器中的氧传递系数（KLa）测定

CYTENA的S.NEST微型生物反应器和S.NEST盖子允许在标准细胞培养板的每个孔中吸排空气，实现每个孔内不同混合周期的连续往复混合（图1A）。因此，S.NEST微型生物反应器将悬浮培养和晚期条件引入到早期细胞系开发（CLD）流程中，提供了比96孔和24孔板静态培养更多的生长空间和氧气。目前已证明，S.NEST的微孔板混合培养系统可以显著增加氧气传递到水性介质中，为需氧培养提供比静态培养更好的培养环境[2]。因此，我们的混合培养提高了贴壁细胞系HEK293和悬浮细胞系CHO-S的细胞生长速度[3,4]。S.NEST微生物反应器的一个显著特点是，在整个细胞培养过程中，使用附着在每个孔底部的光学的DO和pH传感器实时监测DO和pH值(图1B)。在本篇应用中，我们使用S.NEST板内置的DO传感器演示了不同工作体积和混合速率下S.NEST微生物反应器中的K_La。

图1.（A）S.NEST 系统连续往复混合的原理，（B）每个S.NEST板孔底部附有光学传感器，用于监测DO和pH值

本研究中，所有实验均在S.NEST微型生物反应器中进行，使用1000 µL或1400 µL的DPBS在37℃下进行培养。测试的混合速率包括每个周期50、30、10、5和2秒。我们使用排氧法来确定K_La，该方法包括三个阶段：校准阶段、耗氧阶段和溶氧阶段（图2）。在校准阶段，将DPBS加入S.NEST 24孔板中，盖上S.NEST盖，在S.NEST中以10秒/循环的连续混合速率混合1小时，以确保DO饱和。然后将DO水平校准为100%。下一阶段为耗氧阶段，向S.NEST供气，使DO耗尽，直至DO浓度达到最低。最后一个阶段是溶氧阶段，用空气代替氮气供应。每隔60秒实时监测三个阶段的DO水平。用于确定K_La的时间过程如图2（红框）所示。

图2. K_La测定过程中DO的时间过程，红框表示用于确定K_La的DO的时间过程

1、混合速率是影响S.NEST中K_La的关键因素。在本研究中，我们测试了从2到50秒/周期的五个混合速率，结果表明，K_La随着混合速率的增加而增加（图3）。在使用1.0 mL的DPBS时，K_La在2秒/周期的混合速率下达到了最大值30.48 h^-1。此外，工作体积也是影响S.NEST中K_La的另一个关键因素，增加工作体积对K_La有负面影响。在相同的混合速率下，1.0 mL工作体积的K_La比1.4 mL工作体积的K_La高出约15%。

图3. 不同混合速率下，加入1.0 mL和1.4 mL DPBS的S.NEST的K^La值，误差条代表标准偏差

2、基于本研究的K_La，我们分析了K_La与混合速率的相关性(图4)。K_La与混合速率-1成正比。因此，这些曲线可以作为选择所需混合速率的指导。如图5所示，Sartorius Ambr®15细胞培养系统(图5A)和5L生物反应器(图5B)在不同条件下的K_La值[5,6]。

图4. S.NEST微生物反应器中K_La与混合速率的关系

图5. （A）Ambr15细胞培养系统与（B）5L搅拌式生物反应器在指定条件下的K_La值

本技术说明展示了S.NEST微型生物反应器中K_La值是可调节的。通过调整液体积或混合速率可以获得不同的K_La值，从而确定需氧培养的最佳培养条件。S.NEST培养板中内置的DO传感器还可以使用户能够在所需条件下手动确定K_La值，以进一步进行过程转移和规模放大。