案例应用丨C.BIRD™优化细胞培养环境在24孔悬浮细胞培养板中的应用

发布日期:2024-09-27


引言


在生物制药领域,细胞培养条件的一致性对于从96孔板到生物反应器的扩增过程中至关重要。本研究中,C.BIRD™细胞培养技术以中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系为模型,通过在24孔板中提供自动搅拌,创造悬浮培养环境,优化了悬浮细胞的培养环境,显著提高了细胞的增殖率和蛋白产量。



优化细胞培养环境,加速细胞株开发



在生物制药行业,随着工程化双特异性抗体和抗体-细胞因子融合蛋白等复杂生物制剂的不断涌现,科学家们亟需加快细胞株开发(Cell Line Development ,CLD)的步伐。CLD是一个复杂且耗时的过程,其效率和成功率受到多种因素的影响,其中包括在扩增过程中保持细胞生长特性的一致性和可预测性、扩增过程中的劳动密集。当前,许多实验室仍依赖于传统的静态培养、摇瓶培养或生物反应器培养方法,这些方法在提供均匀一致的细胞生长环境方面存在局限性,尤其是在早期细胞扩增阶段。

为了解决这些挑战,CYTENA BPS推出了C.BIRD微生物反应器技术,它通过在每个孔中提供自动搅拌,为细胞培养提供了一个更加均匀和可控的环境。这种创新方法不仅优化了96孔板的细胞生长和蛋白产量,而且我们进一步将其优化,适用于24孔板,以实现整个CLD过程的无缝衔接,为悬浮细胞建立一个优化的悬浮培养环境。



实验材料与方法



本研究采用CHO-K1和CHO-S单克隆抗体表达细胞系作为模型,比较了传统静态培养、摇瓶培养和C.BIRD™培养方法对细胞生长的影响。细胞在无血清、化学成分定义的CD Hybridoma培养基中培养,使用标准的24孔板进行C.BIRD和静态培养,每个孔的总体积为1400 µL。摇瓶培养则在130 rpm的轨道摇床中进行,总体积为30 mL。所有细胞和C.BIRD设备在37°C、5% CO2水套培养箱中连续培养3天。使用细胞计数器(Bio-Rad, TC20)计数细胞数量和活率。每天的细胞数在同一板的不同孔中独立测量,以避免细胞培养过程中额外的扰动。细胞计数后,每孔补充与细胞计数相同量的培养基,在随后的几天内不再测量。蛋白产量通过ELISA试剂盒(Bethyl Lab, E88-104)测量。统计学采用单因素方差分析。


实验设计由图1所示,在静态培养、C.BIRD培养和摇瓶培养中测定CHO-K1及CHO-S单克隆抗体(mAb)细胞株的总细胞密度、活细胞密度、倍增时间及蛋白产量。CHO-K1的初始接种密度为0.33×106个细胞/mL,CHO-S的初始接种密度为0.5×106个/mL,每天三次测量各组总细胞密度和活细胞密度,为期3天。


图1. 实验设计示意图。比较三种不同的细胞培养方法。这些组的测量提供了不同培养环境下的单个细胞概况


实验结果与讨论



1、 实验结果显示,与传统静态培养相比,C.BIRD™培养的CHO-K1细胞在第3天的活细胞密度和总细胞密度显著提高。C.BIRD组的平均活细胞密度和总细胞密度分别达到2.87×10^6 cells/mL和3.06×10^6 cells/mL,均显著高于静态培养组(图2A和2B)。表明C.BIRD™培养方法在24孔板中改善了细胞培养环境,提供了更高的承载能力。


2、C.BIRD组显著缩短了CHO-K1细胞的平均倍增时间,从35小时缩短到24小时,与摇瓶培养组的23小时相比,没有显著差异(图2C)。这表明C.BIRD™方法提高了CHO-K1细胞的增殖率,并在实验的早期阶段提供了与摇瓶培养相似的细胞增殖特性。而在蛋白产量方面,C.BIRD组的蛋白产量与摇瓶培养组相当,几乎是静态组的4倍(图2D)。这表明C.BIRD™方法在24孔标准板上能够筛选出具有高一致性的细胞特征,这些特征在CLD过程的后期阶段得以保持。


图2. A和B:3组的日活细胞/总细胞密度:24孔板静态培养、摇瓶培养和24孔板C.BIRD培养。C:3组在第3天的倍增时间。D:3组在第3天蛋白质产量。统计学采用单因素方差分析,P值的显著性分别为:>0.05 ns、<0.05(*)、<0.01(**)、<0.001(***)、<0.0001(****)。数据以mean±SD表示。


3、与传统静态培养相比,C.BIRD™培养的CHO-S细胞在第3天的活细胞密度和总细胞密度显著提高。C.BIRD组的平均活细胞密度和总细胞密度分别达到2.67×10^6 cells/mL和3.03×10^6 cells/mL,均显著高于静态培养组(图3A和3B)。此外,与静态组相比,C.BIRD组显著缩短了CHO-S细胞在第3天的平均倍增时间,从42.43小时缩短至29.77小时(图3C)。这些结果表明,C.BIRD方法比静态方法更能有效地提高CHO-S细胞在实验早期的细胞增殖率。


4、在蛋白产量方面,C.BIRD悬浮培养细胞产生17.01µg/mL mAb,而静态培养和摇瓶培养细胞产生10.22和21.11µg/mL mAb。与静态培养法相比,24孔标准板上的C.BIRD方法可以提高蛋白质产量。C.BIRD和摇瓶培养方法之间较高的蛋白产量一致性有效地支持了在CLD过程后期筛选细胞谱具有高一致性的理想克隆。


3. A和B:3组的日活细胞/总细胞密度:24孔板静态培养、摇瓶培养和24孔板C.BIRD培养。C:3组在第3天的倍增时间。D:3组在第3天蛋白质产量。统计学采用单因素方差分析,P值的显著性分别为:>0.05 ns、<0.05(*)、<0.01(**)、<0.001(***)、<0.0001(****)。数据以mean±SD表示。


总结



C.BIRD™细胞培养技术通过提供更高的环境承载能力、增加细胞增殖率以及在后期筛选出具有可比蛋白产量的快速生长细胞,显著改善了24孔板中的悬浮细胞培养环境。这一技术不仅提高了细胞增值率和蛋白产量的一致性,还避免了在挑选不理想克隆上花费的额外时间和成本,为细胞株开发工作流程提供了更有利的培养环境。


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