案例应用丨C.BIRD™优化细胞培养环境在24孔悬浮细胞培养板中的应用

本研究采用CHO-K1和CHO-S单克隆抗体表达细胞系作为模型，比较了传统静态培养、摇瓶培养和C.BIRD™培养方法对细胞生长的影响。细胞在无血清、化学成分定义的CD Hybridoma培养基中培养，使用标准的24孔板进行C.BIRD和静态培养，每个孔的总体积为1400 µL。摇瓶培养则在130 rpm的轨道摇床中进行，总体积为30 mL。所有细胞和C.BIRD设备在37°C、5% CO2水套培养箱中连续培养3天。使用细胞计数器（Bio-Rad, TC20）计数细胞数量和活率。每天的细胞数在同一板的不同孔中独立测量，以避免细胞培养过程中额外的扰动。细胞计数后，每孔补充与细胞计数相同量的培养基，在随后的几天内不再测量。蛋白产量通过ELISA试剂盒（Bethyl Lab, E88-104）测量。统计学采用单因素方差分析。

实验设计由图1所示，在静态培养、C.BIRD培养和摇瓶培养中测定CHO-K1及CHO-S单克隆抗体(mAb)细胞株的总细胞密度、活细胞密度、倍增时间及蛋白产量。CHO-K1的初始接种密度为0.33×10⁶个细胞/mL，CHO-S的初始接种密度为0.5×10⁶个/mL，每天三次测量各组总细胞密度和活细胞密度，为期3天。

图1. 实验设计示意图。比较三种不同的细胞培养方法。这些组的测量提供了不同培养环境下的单个细胞概况

1、 实验结果显示，与传统静态培养相比，C.BIRD™培养的CHO-K1细胞在第3天的活细胞密度和总细胞密度显著提高。C.BIRD组的平均活细胞密度和总细胞密度分别达到2.87×10^6 cells/mL和3.06×10^6 cells/mL，均显著高于静态培养组(图2A和2B)。表明C.BIRD™培养方法在24孔板中改善了细胞培养环境，提供了更高的承载能力。

2、C.BIRD组显著缩短了CHO-K1细胞的平均倍增时间，从35小时缩短到24小时，与摇瓶培养组的23小时相比，没有显著差异（图2C）。这表明C.BIRD™方法提高了CHO-K1细胞的增殖率，并在实验的早期阶段提供了与摇瓶培养相似的细胞增殖特性。而在蛋白产量方面，C.BIRD组的蛋白产量与摇瓶培养组相当，几乎是静态组的4倍（图2D）。这表明C.BIRD™方法在24孔标准板上能够筛选出具有高一致性的细胞特征，这些特征在CLD过程的后期阶段得以保持。

图2. A和B：3组的日活细胞/总细胞密度:24孔板静态培养、摇瓶培养和24孔板C.BIRD培养。C：3组在第3天的倍增时间。D：3组在第3天蛋白质产量。统计学采用单因素方差分析，P值的显著性分别为:>0.05 ns、<0.05(*)、<0.01(**)、<0.001(***)、<0.0001(****)。数据以mean±SD表示。

3、与传统静态培养相比，C.BIRD™培养的CHO-S细胞在第3天的活细胞密度和总细胞密度显著提高。C.BIRD组的平均活细胞密度和总细胞密度分别达到2.67×10^6 cells/mL和3.03×10^6 cells/mL，均显著高于静态培养组(图3A和3B)。此外，与静态组相比，C.BIRD组显著缩短了CHO-S细胞在第3天的平均倍增时间，从42.43小时缩短至29.77小时(图3C)。这些结果表明，C.BIRD方法比静态方法更能有效地提高CHO-S细胞在实验早期的细胞增殖率。

4、在蛋白产量方面，C.BIRD悬浮培养细胞产生17.01µg/mL mAb，而静态培养和摇瓶培养细胞产生10.22和21.11µg/mL mAb。与静态培养法相比，24孔标准板上的C.BIRD方法可以提高蛋白质产量。C.BIRD和摇瓶培养方法之间较高的蛋白产量一致性有效地支持了在CLD过程后期筛选细胞谱具有高一致性的理想克隆。

图3. A和B：3组的日活细胞/总细胞密度:24孔板静态培养、摇瓶培养和24孔板C.BIRD培养。C：3组在第3天的倍增时间。D：3组在第3天蛋白质产量。统计学采用单因素方差分析，P值的显著性分别为:>0.05 ns、<0.05(*)、<0.01(**)、<0.001(***)、<0.0001(****)。数据以mean±SD表示。