案例应用丨heliX+分子互作分析系统在DNA末端非同源修复复合物相互作用研究中的应用

发布日期:2024-08-26



研究背景介绍

DNA的修复功能是维持细胞正常生理功能和稳定遗传性的重要因素,其中DNA双链断裂(DSB)的修复机制包括BRCA1/2介导的同源重组(HR)和典型的 DNA-PKcs介导的非同源末端连接(c-NHEJ)。


对c-NHEJ DNA末端修复通路复合物的结构及功能的了解是应对损伤应答修复机制缺陷相关疾病的科学基础。在该通路中,蛋白Ku70和Ku80形成的异源二聚体(统称Ku)是最重要的蛋白复合物。


通过电镜及X射线对蛋白复合物及晶体结构的分析,已经阐明代谢物IP6(六磷酸肌醇)能够与Ku相互作用,并在原子水平鉴定了其相互作用结合位点。


然而,IP6结合如何影响或调控Ku蛋白复合物的功能,需要通过技术手段进行进一步的研究。


技术背景介绍

switchSENSE是通过芯片表面的DNA纳米杆,实现对分子互作的动力学参数进行测量。相比较传统的分子互作检测技术,其优势主要体现在三个方面:


(1)DNA纳米杆携带荧光基团,待分析物不需要进行标记;

(2)DNA纳米杆可与DNA, 蛋白结合,可进行多种分子模式的互作,包括DNA和DNA结合蛋白,蛋白与蛋白,小分子与蛋白分子结合的相互作用分析;

(3)由于DNA纳米杆在芯片上的自由组装,可进行复杂的三元复合物,双特异抗体与靶点形成的复合物相互作用分析,解决了传统技术在此方面的限制。

switchSENSE技术的原理图如下:



01
研究目的

研究目的
  • 研究IP6是否对Ku与DNA的结合具有调控作用;

  • 研究IP6是否对Ku和XLF相互作用具有调控作用;


02
实验设计


(1)研究IP6是否对Ku与DNA的结合具有调控作用

  • 通过switchSENSE技术将48bp片段大小的DNA固定在芯片的DNA纳米杆上,将不同浓度的Ku分子溶液流过芯片表面与DNA结合;

  • 将Ku分子与IP6进行孵育后,流过芯片表面与DNA结合;

  • Helix+仪器自动进行结合,解离及亲和性的测量。

(2)研究IP6是否对Ku和XLF相互作用具有调控作用

  • 通过switchSENSE技术将Ku分子结合在芯片表面的DNA纳米杆上,将三种不同浓度的XLF分子流过芯片表面;

  • 将上述三种不同浓度的XLF与IP6分子孵育后,流过芯片表面;

  • Helix+仪器自动进行结合,解离及亲和性测量。


03
研究结论


(1)IP6可以促进Ku与DNA结合的稳定性

IP6与不同浓度的Ku孵育后,与DNA的结合动力学数据


根据数据结果,当缺少IP6时,Ku与DNA结合的动力学参数如下:

Kon:6.94 ± 0.16 10 5 M −1 s −1 ,

Koff:2.26 ± 0.03 10 −3 s −1

KD:3.25 ± 0.09 nM

当加入IP6后,Ku与DNA结合的动力学参数如下:

Kon:6.35 ± 0.13 10 5M −1 s −1

Koff:1.27 ± 0.03 10 −3 s −1

KD:1.99 ± 0.06 nM


(2)IP6能够促进XLF与Ku分子结合的稳定性


根据数据结果,当缺少IP6时,XLF与Ku结合亲和性参数如下:

KD1= 3.6 ± 0.6μM,

KD2= 1.9 ± 0.8μM

当IP6存在时,XLF与Ku结合的亲和性参数如下:

KD1= 1.2 ± 0.15μM

KD2= 0.13 ± 0.009μM       

并且,该技术可以直观的反应,XLF与Ku结合的双向性。


04
总结


IP6可以通过促进Ku分子与DNA的结合,促进XLF分子与Ku分子的亲和性,调控c-NHEJ DNA双链断裂修复通路。对于IP6和Ku分子结合的电镜及X-射线结果来说, 以DNA纳米杆为背景的分子互作技术,可以进一步的研究IP6在调控c-NHEJ通路上的功能机制,为传统的结构生物学及互作技术提供了一种更加灵活和多样的技术手段。

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