案例应用丨Helix+多模式分子互作仪在酶结构与酶和底物结合动力学研究中的应用

该数据证明了PG家族蛋白PGLR和ADPG2与PGIP结合受到影响的结构基础

对于PG蛋白和底物分子的结合，同样存在结构上的影响。将植物中的PGLR和ADPG2和细菌与真菌中的PG家族蛋白进行蛋白序列和结构的比较，发现在上述物种中，酶活性位点是由NTD，DD, GHG, RIK四个保守的结构基序组成。通过对保守部位活性位点内的氨基酸进行定点突变，分析了PGLR和ADPG2对PGA的催化水解关键氨基酸，以及不同突变蛋白与其底物DP12结合的亲和常数的差异。

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上数据解析了PGLR和ADPG2蛋白酶活性位点的保守残基

蛋白活性位点关键氨基酸位点的差异，导致了不同的PG蛋白对同一种底物不同的选择和水解消化活性；以及决定着PG蛋白与其特异性底物的结合动力学。为了进一步检测蛋白结构与酶和底物结合的动力学相互关系，本文使用分子互作技术switchSENSE对酶和底物结合的动力学进行了相关研究。switchSENSE是通过芯片表面的DNA纳米杆，实现对分子互作的动力学参数进行测量。该技术的优势在于其DNA纳米杆设计的灵活性，可以通过静态模式以及动态模式，分别对分子与分子之间结合的动力学进行实时的测量，同时可以对生物大分子蛋白结构及大小的相对变化进行测定。其主要的结构如下图所示：

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该技术的主要优势主要表现在以下几个方面：

（1）DNA纳米杆携带荧光基团，待分析物不需要进行标记；

（2）DNA纳米杆可与DNA, 蛋白结合，可进行多种分子模式的互作，包括DNA和DNA结合蛋白，蛋白与蛋白，小分子与蛋白分子结合的相互作用分析；

（3）由于DNA纳米杆在芯片上的自由组装，可进行复杂的三元复合物，双特异抗体与靶点形成的复合物相互作用分析，解决了传统技术在此方面的限制。

由于PG蛋白的底物种类繁多，具有不同聚合体形式，为了检测具有不同聚合形式的底物和同种PG蛋白的实时结合动力学，需要进行自动化的连续上样，且可以在同一块芯片上实现。

switchSENSE具有96孔自动化上样装置，且芯片上带有配体的DNA纳米杆可以进行完全解离后，使得芯片再生，继而自动化进行多种底物的结合解离分析。

本文通过这种方式，对不同聚合形式的底物与PGLR和ADPG2的结合动力学进行了实时的分析，结果如下：

4以上数据分析了不同的底物和PGLR以及ADPG2结合的实时动力学

结合动力学的精确测量，对于研究PGLR和ADPG2等PG蛋白的功能是必不可少的。这一数据直观的反映了酶和底物结合的状态，包括形成复合物的速率，复合物的稳定性等。

数据显示了ADGP2相比于PGLR，其和低聚的底物具有更高的亲和性，但是，在结合速率常数上，对于低聚的果胶底物，ADPG2和PGLR并没有显示出明显的差异，这也说明，其结构上的差异，并没有引起两种酶对底物的结合，但是或许影响了酶和底物复合物的稳定性。

为了更进一步对动力学的差异和酶对底物的水解的差异的研究，本文进行了该方面的相关性分析。研究显示，由于两种酶对不同聚合形式底物的亲和力的差异，ADPG2和PGLR在发挥活性上是具有时间顺序，ADPG2可以进一步水解PGLR消化水解后的终端产物。

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以上数据说明不同的酶底物动力学亲和性与不同的底物催化能力的关系

本文通过对PG蛋白家族成员PGLR和ADPG2的结构分析，阐明了两种果胶水解酶的蛋白高级结构，并对酶活性位点的关键残基位点进行了解析；这些结构的差异，引起了酶与底物结合的不同的动力学。动力学的检测让研究者们直观的观测到酶和底物结合的状态以及对不同底物的选择性，酶和底物结合后形成复合物的稳定性等。以上决定了酶在细胞壁中果胶的水解中所占据的时空特点，这对于植物细胞的生长，根茎的发育等，都具有一定可科学指导价值。