案例应用丨DNA损伤修复激酶ATR通过促进泛素化激活FANCD2-FANCI复合物

在缺乏ATR激酶的情况下，模拟的磷酸化的蛋白FANCI仍旧可以促进FANCD2的泛素化，这说明ATR激酶通路实质上是通过促进FANCI的磷酸化激活FA信号通路，促进FANCD2的泛素化发生。那么磷酸化是如何影响泛素化发生的呢？为了回答这个问题，本文纯化了三种蛋白：模拟的来源于鸡的FANCI磷酸化蛋白（简称D2-I 3D），在该蛋白中，三个保守的磷酸化位点，丝氨酸558，丝氨酸561和苏氨酸567，被突变成天冬氨酸；野生型的FANCI蛋白（D2-I WT）和失去被磷酸化功能的FANCI蛋白（D2-I 3A），在该蛋白中，上述三个保守位点被突变成丙氨酸。

这三种蛋白对于FANCD2的泛素化分别有什么影响呢？本文进行了体外的泛素化检测，在44bp的dsDNA和重组的FA核心蛋白复合物存在的情况下，WT和I-3A对FANCD2的泛素化影响是相一致的，在20分钟内，约40%的FANCD2发生了泛素化；而I-3D的泛素化效率明显提高，在10分钟后，约75%的FANCD2蛋白发生了泛素化，20分钟后，大于95%的FANCD2发生了泛素化。这些结果说明，FANCI的磷酸化可以促进FA对FANCD2的泛素化作用。

ATR的磷酸化位点位于FANCI的灵活可变区域，与FANCI的泛素化位点，FA核心复合物成分，Ube2T及USP1-UAF1结合位点相邻，报道将其称为“磷酸环”。在非泛素化的鼠的D2-I晶体结构中，磷酸环位于FANCD2和FANCI蛋白互作界面，处于一个氢键构成的网络之中；但并没有相关的电镜结构数据，说明磷酸环的内部是灵活可变的，并不容易进行相关的结构解析。

为了从结构的角度分析FANCI的磷酸化是如何促进FANCD2泛素化的发生，本文对D2-I 3D，D2-I3D和DNA，泛素化的D2-I 3D和DNA进行了电镜结构解析，其分辨率分别是4.1，3.5和4.4Å.  D2-I 3D在没有DNA存在的情况下，在结构上呈现的是更加“打开”的状态，这说明磷酸化本身并不能改变蛋白复合物的结构状态，但是在DNA存在的情况下，泛素化的D2-I 3D与DNA结合上呈现的是更加紧凑的状态。那么是泛素化的发生，还是DNA存在的本身，对D2-I 3D的结构产生了影响呢？影响的意义是什么呢？在DNA存在的情况下，D2-I 3D与DNA的结合呈现了紧凑的状态，这与之前的研究结果相悖，已有的报道发现非泛素化的DNA-D2-I结合复合物中，D2-I呈现的是“打开”的状态，紧凑的结构状态是由于泛素化得到发生而引起的。

本文构建了一个DNA-D2-I 3D复合物模型，并将其与已报道的D2-I的结构进行比较。除了FANCD2的可变的N端区域，D2-I 3D的紧凑状态并不影响单个亚基的总体结构状态。为了实现与DNA结合的紧凑状态，FANCD2和FANCI 3D会绕着它们N端形成的铰链进行旋转，使得它们的蛋白C端可以接近，进而发生互作，并与DNA形成一个新的相互作用界面。结合上述的数据结果表明，FANCI的磷酸化在DNA存在的情况下，可以促进D2-I复合物与DNA结合的紧凑性，DNA在其中的作用，可能充当一个旋转轴心的作用，或是类似于支架的作用；如果没有DNA的存在，这种旋转并不会发生，新的互作界面也不会发生。

那么这种紧凑的结构状态的发生的意义是什么呢？由于结构的改变，使得FANCD2和FANCI隐藏的泛素化位点暴露，FA核心复合物复合体成分可以与其发生作用。

以上结构数据表明，磷酸化通过以下机制促进了D2-I的泛素化：磷酸化的蛋白复合物，在dsDNA存在的情况下，发生结构上状态的变化，从“打开”的状态转变为“紧凑”的状态，这种转变，暴露了关键的泛素化位点Lys563。

除了结构上的改变，促进了泛素化的发生，那么FANCI的磷酸化是否影响了复合物与DNA结合的动力学，比如降低解离率，延长复合物与DNA互作的时间等。已有的研究发现，模拟的FANCI磷酸化突变通过增加复合物与DNA结合的亲和性，促进FANCD2的泛素化。为了进一步验证D2-I 3D和野生型复合物D2-I与DNA结合的亲和性差异，我们通过凝胶迁移滞后实验（EMSA）检测D2-I WT，D2-I 3A和D2-I 3D与DNA结合的亲和性。但是，本文并没有检测到明显的差异。

本文考虑到EMSA技术受限于分辨率，对细微的差异无法进行检测。例如，比较慢的结合/解离与较快的结合/较快的解离可能具有相似的亲和性。因此，我们采用了SwitchSENCE技术对上述复合物进行了实时动力学检测。SwitchSENCE采用荧光标记的DNA纳米杆，纳米杆固定在芯片表面，并处于可变的电场之中。当待结合的蛋白经微流控液流流经芯片表面时，DNA和蛋白结合的实时动力学可以通过检测DNA纳米杆在电场中的荧光改变速度进行测量。由于双链DNA纳米杆一端固定在芯片上，另一端设计成环状结构，因此可以避免蛋白复合物从DNA链上的滑落，导致数据产生的复杂性和不可控性。结果显示，三种不同的复合物在结合/解离动力学上不存在明显的差异。但相比较于EMSA，对于三种复合物，SwitchSENCE测得的亲和性更加高，这也可能是由于DNA存在形式的差异。

以上结果说明，复合物的磷酸化状态并不能明显改变其与DNA结合的动力学。

虽然已经验证复合物的磷酸化可以影响其开合状态，但是否与其泛素化的发生相关，并不清楚。本文认为D2-I的磷酸化主要是通过影响发夹结构的开合状态影响复合物的泛素化。为了检测FA核心复合物蛋白与D2-I WT和D2-I 3D结合的差异，我们在DNA缺失或在限制浓度下进行泛素化检测。首先，在DNA缺失的情况下，D2-I WT复合物并不能有效的发生泛素化，2小时反应，仅有大约5%发生了泛素化反应。但是D2-I 3D发生泛素化的速率是D2-I WT的10倍左右，即使在DNA缺失的情况下。所以，泛素化的发生依赖于磷酸化，但是否依赖于DNA呢？或则磷酸化本身是依赖于DNA存在的呢？有限的DNA的加入，促进了D2-I 3D的泛素化，但对D2-I WT并未产生影响。这说明，泛素化依赖于复合物的磷酸化，但DNA的存在可以极大的促进该泛素化过程。DNA是通过什么机制促进这一泛素化过程的呢？DNA在该过程中的作用是什么呢？本文推测是起到稳定复合物“紧凑”的状态。

为了更进一步从构象的角度探究D2-I WT和D2-I 3D的存在差异，我们通过定量交联质谱对溶液中的复合物状态进行分析。我们使用一种半衰期较短，UV-激活的异源双功能交联剂sulfosuccinimidyl 4,4’-azipentanoate (sulfo-SDA），在DNA存在与否的情况下，对D2-I WT和D2-I 3D复合物分别进行交联，可以获得短时状态下的分子内部互作状态。对于D2-I 3D复合物来说，DNA不存在时的交联模式和构象状态与两种复合物DNA存在时的差异比较一致，但与DNA不存在时，D2-I 3D的差异比较明显。这说明，磷酸化与DNA分子都是影响复合物构象状态的因素。那么磷酸化因素是如何影响复合物构象状态的呢？本文在DNA缺失的情况下，对D2-I WT和D2-I 3D分别进行了定量交联质谱分析。结果发现，两种复合物在DNA缺失的情况下，形成了相似的构象，但是特定的交联数量存在差异，说明在构象的状态上存在一定的差异。

通过更精细的数据分析，本文发现，在D2-I WT和D2-I 3D两种复合物的构象状态方面主要存在两种主要的差异。首先，不同的交联簇表明两种复合物的无序N端位置上的不同；在D2-I WT复合物中，FANCD2的N端与FANCI的patch交联，该位置位于D2-I复合物互作界面，并与磷酸环和FANCI-K525氨基酸相接近。这种交联的状态在D2-I 3D复合物中并不是主要的交联，相反，其与FANCI交联的区域与复合物互作界面相距较远。

以上数据进一步表明，磷酸化和DNA的结合对复合物D2-I具有相似的效应，改变其N端序列的交联状态，促进复合物转变为更为“紧凑”的状态。

其次，在泛素化位点附近，具有特定的交联模式。我们知道，在D2-I复合物的“打开”状态中，这些关键的泛素化位点未经暴露，在D2-I 3D复合物中，交联模式的改变，使得这些氨基酸残基发生暴露，使得FA复合物蛋白更易与其接近。

除了复合物N端的交联状态，本文也同时对C端的交联模式进行了分析。这种交联仅在DNA存在的情况下，复合物呈现更为”紧凑“的状态时发生。D2-I WT和D2-I 3D在DNA存在时，都可以围绕DNA形成“紧凑”状态，但在D2-I 3D复合物中，比起D2-I WT，C端交联高达3倍的富集程度。表明在D2-I 3D复合物中，“紧凑”状态的维持时间，长于D2-I WT。

通过以上结果，本文证实，D2-I复合物存在“开”和“合”的构象动态平衡，无论DNA存在与否。与DNA结合导致的效应相似，磷酸化可以改变复合物的构象平衡，促进复合物从“打开”状态向“紧凑”状态的转变。