在生物制药领域，细胞株开发（CLD）是生物制品研发的关键环节，而单细胞克隆（SCC）作为生成稳定蛋白生产细胞系的重要步骤，却面临着劳动密集和耗时的挑战。优化 SCC 流程，对于加速新生物制品的上市进程、降低成本具有深远意义。过去几十年，治疗性生物制品市场迅速增长，预计2025年全球市场收入将达约3000亿美元，其中单克隆抗体（mAb）占比颇高[1]。哺乳动物细胞，尤其是CHO细胞系，因易于培养、产量高、翻译后修饰有效、人源兼容且获FDA批准等优势，成为生物制品生产的主流细胞系。
CLD是生物制品开发的关键步骤，旨在从SCC中找到高产细胞系，但该流程劳动密集且耗时长久。在SCC流程中，生物制药公司必须遵循FDA和欧洲药品管理局规定以证明生产细胞系的克隆性[2,3]，常用方法包括有限稀释、荧光激活细胞分选（FACS）和单细胞分配等。本研究中，我们采用CYTENA的 F.SIGHT™ 2.0 单细胞分配器和C.BIRD™微生物反应器，聚焦CLD 中的SCC流程优化，尤其是在细胞克隆早期阶段，以加速 CLD进程，降低成本，提高效率。单细胞分配器不仅保证了细胞分配器的单克隆性，而且具有较高的细胞存活率和克隆效率[4]。
我们的夏令营覆盖了广泛的科技领域，包括计算机编程、机器人技术、3D打印、无人机应用等。我们的课程由一支拥有丰富经验与知识的导师团队授课，他们将为孩子们提供个性化的指导和辅导，使孩子们能够更好地理解和掌握科技知识。
本研究选用表达mAb的CHO-S细胞系，在添加特定成分的 CD Hybridoma Medium 中培养。
分别使用标准 96 孔板和 24 孔板进行 C.BIRD™培养和静态培养，摇瓶培养则在特定转速的轨道摇床中进行，所有培养均在 37°C、5% CO₂水套培养箱中连续培养3天。
96孔板对比测试中，设置不同初始细胞密度（1×104, 1.5×104, 2×104和3×104细胞/孔），C.BIRD™混合模式为连续模式，混合速率 50秒/循环。24 孔板对比测试中，同样设置不同初始细胞密度（5×104, 1×105, 2×105和5×105细胞/孔），C.BIRD™混合模式为连续模式，混合速率25秒/循环。培养4天后计数细胞数量和活力。
运用 F.SIGHT™ 2.0 将单细胞分配至96孔和384孔板，使用EX-CELL CHO Cloning Medium，96孔板的每孔体积为200 µL， 384孔板的每孔体积为80 µL。F.SIGHT™ 2.0 通过高分辨率成像实现单细胞的全自动分离和荧光分选。将CHO-S细胞稀释至5×105个/mL，将50 µL细胞悬液装入培养皿。分配器芯片快速生成小液滴，在运行过程中对喷嘴区域进行连续成像，确认液滴为单个细胞，参数正确。然后将这些经过验证的细胞分配到选定的孔中（图1）。
比较静态、摇板和C.BIRD™微反应器培养方法对细胞生长率的影响（图2）。所有细胞在37℃和5% CO2条件下培养。96孔组细胞经单细胞分配后，静态培养14天，再转移到24孔板继续培养4天；摇板组在96孔板静态培养后，转移到摇板培养；C.BIRD组则在96孔板静态培养10天后，用C.BIRD微反应器培养4天，再转移到24孔板继续C.BIRD培养。384孔组在单细胞分配后静态培养10天，然后转移到96孔板继续培养，其中C.BIRD组使用C.BIRD微反应器。在单细胞分配后的第14天和第18天，使用细胞计数器测量细胞密度和活力。
图2. 克隆扩增实验设计示意图。(A)单细胞克隆流程从96孔平板培养开始。(B)单细胞克隆流程从384孔平板培养开始。
96孔板培养结果显示，接种密度为不同数值时，C.BIRD™培养在第天的活细胞数量显著高于静态培养，随着接种细胞数增加，C.BIRD™培养的活细胞数的优势明显，且各组细胞活力均维持在85%以上（图3A）。
24孔板培养结果显示，不同接种密度下，C.BIRD™培养在第4天的活细胞数量同样高于静态培养，C.BIRD™培养各接种密度的细胞活力多维持在90%以上，而静态培养在高接种密度时细胞活力有所下降（图3B）。结果表明，C.BIRD™微生物反应器在低接种密度下显著提升细胞生长，在96孔板中细胞生长提升约 2.1-2.7倍，24孔板中提升约1.3-1.8倍，且不影响细胞活力。
图3. 静态培养和C.BIRD培养的活细胞数和细胞活力。(A) 96孔平板培养，C.BIRD混合条件为连续50秒/循环。(B)对于24孔平板培养，C.BIRD混合条件为连续25秒/循环。
96 孔板接种单细胞并培养10天后，C.BIRD™培养组在部分细胞达到 5% 汇合度时应用反应器（图4A），结果显示，C.BIRD组在96孔板中静态培养10天后，以50秒/周期的连续混合模式使用C.BIRD微反应器培养4天。第14天，C.BIRD组的平均活细胞数是静态培养的两倍，达到1.94×105个细胞/孔（图4B），细胞活力分别为91.4%、88.8%和94.1%（图4C）。继续培养至第18天，C.BIRD组的细胞数达到1.56×106个细胞/孔，比其他组高出1.6倍（图4D），静态、摇瓶和C.BIRD培养组第18天的细胞存活率分别为91.7%、86.4%和89.3%（图4E）。第14天和第18天的个体克隆细胞数如图4F所示。
384孔板接种单细胞并培养10天后，通过显微镜选择40%汇合度的孔进行分析（图5A）。这些细胞随后被转移到96孔板中，其中静态培养组继续静态培养，而C.BIRD培养组则在C.BIRD微反应器中培养4天。结果显示，C.BIRD培养的平均活细胞数为2.30×105个细胞/孔，高于静态培养的1.83×105个细胞/mL（图5B）。在第14天，静态和C.BIRD培养组的细胞存活率分别为90.1%和95.0%（图5C）。继续培养至第18天，C.BIRD培养组的平均活细胞数达到2.01×106个细胞/孔，是静态培养组1.09×106个细胞/孔的约1.8倍（图5D）。两组的细胞存活率在第18天均为93.8%（图5E）。图5F展示了第14天和第18天单个克隆的细胞数量。
图4. (A)从96孔平板培养开始，克隆扩增流程中选定孔的细胞融合度（5%）示意图。（B-E）克隆扩增流程的活细胞数和细胞活力从96孔板开始。(F)第14天和第18天的单克隆细胞数。
图5. 从384孔平板培养开始，克隆扩增流程中选定孔的细胞融合度（40%）示意图。（B-E）从384孔板开始克隆扩增流程的活细胞数和细胞活力。(F)第14天和第18天的单克隆细胞数。
C.BIRD™微反应器不仅提高了悬浮CHO细胞在96孔和24孔板中的生长，还能在相同培养期内从相对较低的初始细胞密度中增加细胞数量，且不牺牲细胞活性。通过在SCC工作流程的早期克隆扩增阶段应用C.BIRD™微反应器，为科研人员提供了一种新的SCC工作流程，以缩短获取足够细胞数量进行扩增的时间，并最终减少扩增至48孔、12孔或6孔板的步骤。
同腾睿杰（上海）生物科技有限公司作为 Cytena C.BIRD™中国代理商，为您提供优质的售前售后服务。
联系电话：021-50826962
联系邮箱：sales@ttbiotech.com
