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癌症干细胞假说认为，肿瘤由一小群表现出干细胞特性的细胞驱动和维持。研究人员依赖于肿瘤球形成实验来识别和扩增这些癌症干细胞[1]。肿瘤球是来自癌症干细胞的固态球形细胞形成，不是由其他来源的细胞聚集而成。这些细胞可在无血清、非粘附条件下生长，并且可以在体外用于表征癌症干细胞群体[2]。

MCF-7是一种模型乳腺癌研究细胞系，用于乳腺球测定，用CD44和CD24等标记物检测癌症干细胞特性。乳腺球发育的关键步骤是分离单细胞，然后计算成球效率(SFE)[3]。在传统的肿瘤球形成实验中，细胞的接种密度通常在每毫升1,000到100,000个细胞之间变化，而不是仅从干细胞中生长，这可能导致细胞聚集而非真正的肿瘤球形成[4,5]。为了提高肿瘤球的单细胞起源比例，理想的接种方式是每个孔中只接种一个细胞。然而，这在技术上是一个挑战，因为需要精确地分离和放置单个细胞，同时避免细胞损伤。

WOLF G2单细胞柔性分选系统

单细胞分选的创新应用

NanoCellect Biomedical, Inc. 推出的WOLF G2单细胞柔性分选系统，通过其N1 Single Cell Dispenser，能够通过分离具有特定标记的细胞，高效地获取癌症干细胞，并通过在每个孔中精确沉积单个相关细胞来提高肿瘤球形成效率。

实验方法

第一步：细胞及缓冲液准备

MCF-7 (ATCC HTB-22)细胞在T75瓶中生长，培养基由DMEM、10%FBS及1% antibiotic-antimycotic组成。使用0.05%胰蛋白酶-EDTA制备成单细胞悬浮液，与4℃保存。MCF-7细胞和SpectraComp补偿Beads用PE小鼠抗人CD24和FITC小鼠抗人CD44染色，在细胞染色之前，用Human TruStain FcX-FC受体阻断液阻断MCF-7细胞10分钟，然后用抗体染色。使用DRAQ7 (Invitrogen #D15107)作为活性染料，从分类中排除死细胞。

第二步：单细胞分选及结果选择

使用补偿Beads创建补偿矩阵以校正荧光通道溢出，使用单染色对照设置适当的门以从表达CD44^high/CD24^low的群体中进行分类(图1)。使用WOLF G2对MCF-7细胞以1 x10^5细胞/mL的浓度进行分选，并将单个细胞分选至预先填充有200 µL完全克隆介质的96孔超低附着板中，完全克隆介质由MammoCult Human Medium Kit组成，补充有4 µg/mL肝素和0.48 µg/mL氢化可的松。分选后，板子在37°C和5% CO2条件下孵育前，以100 x g离心3分钟。

图1. 从MCF-7细胞中筛选乳腺球生成细胞的圈门策略：对肿瘤干细胞标记CD44^h^igh/ CD24^l^ow的人群进行分类需要适当的圈门。A.创建了一个样品门，以排除碎片，B.紧接着圈单细胞门以排除双细胞，C.将单细胞门应用于死活图以排除死细胞，然后将其应用于CD44-FITC和CD24-PE 的双变量图，D.从双变量图中，制作一个包含CD44^high/CD24^low细胞的门来进行排序，在蓝色门中突出显示。

第三步：对照实验

作为对照，使用额外的单细胞盒将10个细胞/孔沉积，以复制当前技术。细胞沉积在预先填充有200 µL克隆介质的96孔板上，随后在37°C和5% CO2条件下孵育前，以100 x g离心3分钟。

第四步：观察与可视化

在第0天、第4天和第7天观察板子，并在第4天更换介质，即去除100 µL的废介质并补充100 µL新鲜克隆介质。使用相差显微镜（ECHO Revolve）在10倍放大下追踪沉积细胞的生长。此外，使用5 µM的Calcein AM和25 µg/mL的碘化丙啶（PI）对球体进行染色，并使用FITC和TRITC滤光片（ECHO Revolve）在10倍放大下进行可视化。

第五步：肿瘤球形成效率（SFE）的测定

在第7天手动计数每个孔中的乳腺球数量，并与第0天沉积的细胞数量进行比较，以找出起源于单个细胞的乳腺球。将此数量除以板上的孔总数，以确定SFE。使用1个细胞/孔和10个细胞/孔制备的板子来计算和比较此值。实验重复三次以确保结果的可靠性和重复性。

实验结果

1、显微镜分析显示，WOLF G2分选的细胞形成的肿瘤球在第7天平均直径为42.9 ± 13.2 µm，并且观察到从第0天、第3天以及第7天的生长（图2）。第7天的肿瘤球用Calcein AM和碘化丙啶（PI）染色，以可视化活细胞和死细胞。低细胞密度的板显示出核心区域PI染色较少（图3A），而10个细胞/孔的接种显示出更多死细胞区域（图3B）。

图2. 从两个不同的孔中生长的肿瘤球体的代表性图像:在第0、4和7天用10倍放大镜分析乳腺球体。第0天用于确认单细胞沉积，随后的几天用于测量整个过程的生长情况。每隔一天更换一次克隆培养基，以满足球体生长。到第7天，球的平均直径为42.9 ± 13.2 µm。比例尺，200 µm。

图3. 第 7 天染色肿瘤球体的代表图像：用荧光显微镜观察Calcein AM（绿色）和PI（红色）染色的肿瘤球。A. 源自单个细胞的球体显示出明显的中心，死细胞被可继续增殖的静止细胞包围。B. 然而，源自10个细胞/孔的球体显示出更多的死亡细胞，增殖边缘较少。

2、使用WOLF G2进行的单细胞分选结果显示，第0天只有9.2 ± 2.8%的孔为空，1.5 ± 0.4%的孔含有两个或更多细胞。到第7天，平均有82.1 ± 2.7%的孔含有肿瘤球，其中80.7 ± 2.7%的肿瘤球起源于单个细胞（图4）。

图4. 单细胞克隆第0天单孔细胞数和第7天肿瘤球生长情况:第0天单孔细胞数平均为89.3 ± 2.9%，第7天单孔细胞继续生长的平均为80.7 ± 2.7%。

3、第0天1个细胞/孔的肿瘤球的数量是10个细胞/孔的4倍(图5)。这增加了下游应用所需的起始肿瘤球数量。

图5. 1个细胞/孔和10个细胞/孔时的球体形成效率：与10个细胞/孔相比，1个细胞/孔沉积时的球形形成效率更高，是10个细胞/孔的4倍。

总结

WOLF G2单细胞柔性分选系统可以支持免疫肿瘤学和药物筛选平台，对进行肿瘤球测定以进一步研究癌症起到了重要作用。本研究中，WOLF G2单细胞柔性分选系统展示了其在增加每个96孔板的肿瘤球数量方面的效率，由于其能够隔离特定的目标群体并温和地分选它们，从而提高了单细胞克隆性。