案例应用丨I.DOT 经济化土壤样品中DNA的宏基因组和扩增子文库的制备

测序成本的大幅降低使更多的研究人员在他们的研究领域特别是在微生物生态学领域利用下一代测序技术了解微生物栖息地的多样性。当前大型测序项目的成本受到实际操作时间和样品制备成本的限制。然而，利用液体处理程序和液滴分配技术的新的自动化或半自动化工作流程在减少工作时间和缩小反应量方面很有发展前景——最终降低成本。

由于土壤样本的多样性，因此对于高通量DNA（HT）提取工作流程来说尤其成问题。此外，由于步骤难以自动化、耗时或包含有害物质，大多数常规操作手段并不适用于高通量测序。虽然有几种商业的土壤特异性HT DNA提取试剂盒，但这些试剂盒尚未在不同的土壤类型上进行独立测试。作者选取了三种不同的DNA提取试剂盒做测试，提取DNA并提出了一个完整的高通量工作流程，从DNA提取到小型化Illumina扩增子或宏基因组文库。

图1 实验设计

顶部：实验设计。采用五种不同的土壤类型对三种不同的HT DNA提取方法进行了基准测试。通过DNA提取的质量、数量、长度和观察群落特征来评价DNA提取效果。I. DOT one随后被用于小型化宏基因组和扩增子。底部：从DNA提取到宏基因组或扩增子的每一步的实际操作时间、总时间和成本。时间反映了一个96孔板的处理时间，成本为每个样品的计算。对于宏基因组和扩增子，两个96孔板可以同时处理，只增加少量的总时间。

图2 标准和小型扩增子的群落特征比较

(A)按土壤类型分面，在属水平上跨反应体积的群落剖面热图。(B) ASV的差异相对丰度图。(C) Hellinger转化相对丰度，PCA。过滤掉至少一个样品中相对丰度不超过0.1%的asv。

在属水平上，标准扩增子文库和小型化扩增子文库之间的群落概况相似(图2A)。在对标准方案和小型化方案之间的所有ASV进行差异丰度分析时，发现共有19个ASV存在差异丰度(图2B)。仅使用相对丰度高于0.1 %的ASV，不同文库制备方案所解释的方差占观察到的总方差的0.9%（PERMANOVA，p=0.03）（图3C）。

小型化方案有效地将扩增文库制备的化学和塑料成本从4.9美元降低到3.6美元。

图 3

(A)按土壤类型分面的属级反应体积群落剖面热图。(B)各属的差异丰度图(C) Hellinger转化相对丰度，PCA。在至少一个样品中相对丰度不超过0.1%的属被过滤掉。

在属水平上的相对丰度比较显示，无论土壤类型如何，标准方案和小型化方案之间的剖面非常相似(图3A)。没有发现鉴定的属在不同的方案之间差异丰富(图3B)。仅使用相对丰度大于0.1%的属，差异可以由不同的文库制备方案解释占观察到的总方差的0.3% (PERMANOVA, p=0.21)(图3C)。

作为方案优化步骤的一部分，测试了不同比例的样品纯化珠(SPB/IPB)以获得最佳片段大小分布，因为小型化方案观察到片段向较短片段的转变。将Illumina DNA文库制备小型化10倍，将我们制备宏基因组的化学和塑料成本从52.2美元降低到7.3美元。