案例应用丨Refeyn质量光度法的原理

这种噪声源于光的量子性质，导致到达探测器的光子数量随机波动。如下图所示，玻璃表面的反射会产生非常不均匀的图像，这种不均匀性与镜头噪声一起，成为噪声信号的主要来源。此外，机械振动或漂移引起的背景波动也会影响数据质量。

比率测量图像中的特征来自与玻璃表面相互作用的单个分子。这些纳米散射体比成像所用的波长小得多，因此用点散射函数（PSF）来表示。PSF描述了成像系统对点光源或点物体的响应，取决于成像波长和物镜的数值孔径（NA）。波长越短、NA越大，设备的PSF就越小。因此，在同一仪器上测量的不同质量的分子会显示出形状相同但强度不同的PSF（下图）。例如，甲状腺球蛋白比牛血清白蛋白（BSA）大十倍，因此其信号要强十倍。在1分钟的采集过程中，可检测到数百个此类事件，即使是复杂的样品，也能提供质量分布的直接信息（下图）。

重要的是，每个散射光信号必需要很好地分离，否则拟合误差会因PSF在时间和空间上的重叠而使结果模糊不清。因此，必须将样品浓度保持在可进行单分子检测的水平（通常小于100 nM），所以我们在使用MP测量分子质量时只需要极少量的样品。

质量光度直方图中出现的单个或多个峰值可使用高斯近似进行拟合，峰值中心显示的分子质量表示该组分的测量质量。

由于上述所述的测量误差，测量质量可能会偏离预期质量。并且不仅样品测量本身存在误差，校准测量中的误差也会最终导致偏差。通常情况下，误差低于预期质量的5%。我们可以通过多次重复实验，平均各次实验的误差来更好地估计校准误差，从而提高准确性。下图显示了预期分子质量与质量光度测量结果的相关性。

精确检测和量化PSF的能力主要取决于测量图像中的噪声水平。平均计算测量影片的帧数越多，每幅图像收集到的光斑数量就越多，从而降低了测量图像中由镜头噪声引起的波动，就能够检测到更小的蛋白质。帧数增加的缺点是降低了时间分辨率，可能需要调整蛋白质浓度，以避免每张平均图像检测到结合粒子的PSF重叠。

下图显示了蛋白质A（42 kDa）和AAV粒子（约3.7MDa）产生的信号，后者产生的信号几乎是前者的数百倍，这反映了质量光度法具有非常宽的检测限。

分辨率表示多峰值直方图中峰值的区分度，这一重要参数与单个峰的宽度直接相关，标准偏差通常为峰位的约10%。当两个峰中心之间的距离大于它们的半最大全宽（FWHM）之和时，就可以分辨出这两个峰。如下图显示，在低质量（66 kDa）的条件下，质量光度法可分离出仅相差约25 kDa的两个峰（BSA和蛋白质A）。当质量较高时（甲状腺球蛋白，670 kDa），由于甲状腺球蛋白的FWHM较大（部分原因是样品的糖基化程度较高），分辨率则将增加到约85 kDa。