案例应用丨S.NEST怎样反映细胞培养状态?

在细胞培养过程中评估细胞生长和活力十分重要，技术的进步使离线细胞监测成为可能，与在显微镜下手动计数相比，节省了研究人员更多的时间。然而，这种方法效率依然低下，不适合高通量或连续培养。因此，需要实现实时监控，包括激光浊度、吸氧速率(OUR)、溶解氧(DO)和pH值等。

溶解氧和pH值的测量已广泛应用于生物反应器的在线监测。它是分析细胞生长和代谢的必要条件。DO水平随生物量的增加而降低，这与细胞呼吸和OUR有关。随着细胞呼吸和葡萄糖代谢产生更多的CO₂和乳酸，pH值会降低。这两个工艺参数是细胞评估的关键指标，并已被广泛用于大型培养平台，包括摇瓶和生物反应器。但大规模培养劳动强度大，耗时长。

S.NEST微生物反应器的开发目的是通过在较小的范围内提供强大的实时监控来解决这些挑战。它有四个腔室，每个腔室由加热模块、水托盘、湿度和二氧化碳传感器组成，以独立控制每个腔室的环境(图1A)。可利用S.NEST盖子实现细胞的混合培养。专利盖子上的冷凝设计能有效地减少蒸发(图1B)。S.NEST盖子的96或24流体通道可以通过气动混合使培养基更均匀(图1C)并通过固定在微孔板底部的光学传感器点监测DO和pH(图1D)。

图1  (A) S.NEST培养系统包含4个独立的腔室。(B)可消耗的S.NEST盖子，带有防止蒸发的冷凝设计。(C)S.NEST盖子混和培养基，使培养体系更加均匀。(D) S.NEST系统实时监测DO和pH。传感器点附着在微孔板底部。

细胞分别以2.5x10⁵ /mL、5x10⁵ /mL和1x10⁶ /mL的密度接种于24孔板中，并加入培养基作为对照(图2A)。连续监测8 天 DO和pH。我们发现每个DO和pH曲线都有两个转折点。各组的DO和pH曲线在开始时均下降(图2)。各DO和pH组的性能下降与细胞密度有关。高接种密度组的DO和pH下降趋势大于低接种密度组(图2A)。在第一个转折点，DO和pH的下降曲线变平缓，可能是由于细胞生长状况和细胞代谢的变化。在培养期后期，观察到第二个转折点，各组的DO和pH曲线呈上升趋势，与细胞接种密度呈正相关(图2A)。为了检验DO和pH曲线是否与细胞生长曲线相关，测量细胞生长和活率。接种密度较高的细胞总细胞密度(TCD)和活细胞密度(VCD)较高，但在培养期结束时，细胞活力较低(图2B)。

在第4天，2.5x10⁵ cells/mL、5x10⁵ cells/mL和1x10⁶ cells/mL的接种组中，倍增时间分别为41.102和136 h(图2B)。由于在DO和pH曲线上观察到两个转折点，我们进一步研究了转折点与细胞生长曲线和代谢之间的关系。

图2 (A)细胞密度接种示意图。不同细胞密度下DO和pH曲线数据。(B)每隔2天测定并分析细胞总密度、活细胞密度、活率和倍增时间。数据以平均值±SEM表示。

结果显示DO值下降到80%左右，细胞倍增时间约为30小时(图3A-C)。与细胞接种密度有关，1 M/mL的细胞接种密度倍增时间最短，表明细胞生长最快。当细胞活率下降到90%左右时，DO值开始增加(图3D-F)。起始细胞密度越大，转折点出现的越早，表明细胞生长受到的阻力越大。

图3 (A-C)用倍增时间分析不同接种密度下DO曲线的第一拐点。(D-F)分析DO的第二个转折点，并与细胞活率进行比较。所有数据均以均数±SEM表示。

影响pH的主要原因是细胞代谢，因此测定了不同实验组培养基中的葡萄糖和葡萄糖的含量。结果显示pH出现第一个拐点时，培养基中乳酸和葡萄糖的量基本接近，葡萄糖含量为初始值的0.5倍(图4A-C) 。当出现第二个拐点时，葡萄糖基本消耗完毕，而乳酸开始成为主要的供能物质(图4D-F)，因此pH开始上升。

图4  pH值受细胞代谢的影响。收集部分培养基进行葡萄糖和乳酸浓度分析。(A-C) pH曲线的第一个拐点与葡萄糖和乳酸浓度有关。(D-F) pH曲线的第二个拐点与代谢转换有关。所有数据均以均数±SEM表示。

利用S.NEST微型生物反应器可以优化细胞培养流程，例如克隆选择，补料批量培养和培养基优化。在本研究中，我们证明了DO和pH值在不取样的情况下对生长动力学和细胞代谢的评估意义，同时也证明了S.NEST培养系统的可靠性。如果在执行最佳克隆选择和其他动态过程(如细胞培养工艺开发、提高抗体生产率)期间将具有DO和pH监测功能的系统应用于工作流程，则有巨大的参考价值。

24孔板上监测的DO和pH数据还为后期在大型生物反应器中培养提供参考，目的是优化生长动力学和细胞活性。除了优化CLD外，S.NEST培养系统在简化T细胞扩增制造过程和pH敏感药物药代动力学方面显示出巨大的潜力。S.NEST的高通量特性与统计学工具(如实验设计方法)相结合，在工艺开发中优化工艺参数方面显示出巨大的前景。