案例应用丨在细胞量不足的情况下如何筛选2208种药物?---DMA平台搭配I.DOT

发布日期:2024-10-21








前置知识点:




DMA(Droplet Microarry),液滴微阵列,通常置于专用芯片上。


IDH(isocitrate dehydrogenase),异柠檬酸脱氢酶,星形胶质瘤细胞常常表现为IDH基因突变。

为了应对IDH1突变复发性胶质瘤的耐药性和治疗方式的有限,使用高通量液滴微阵列(DMA)平台高度小型化筛选2208种FDA批准的药物应运而生。从两名产生耐药性的胶质瘤患者体内获得携带内源性IDH1突变(IDH1mut)的肿瘤球体。


筛查确定了20多种药物,包括维替泊芬(VP),这些药物显著影响了肿瘤球体的形成和存活率。蛋白质组学分析表明,核孔复合物可能是VP的潜在靶点,这表明了一种新的作用机制。通路分析表明,NUP107是与VP反应相关的潜在上游调节因子。对公开可用的基因组数据集的分析显示高NUP107表达与IDH1mut星形细胞瘤生存率降低之间存在显著相关性,表明NUP107可能是一种VP反应的潜在生物标志物。


这项研究展示了如何用小型化3D胶质瘤模型确定核孔复合物为药物开发的潜在靶点。这些发现为支持VP和其他已鉴定化合物治疗IDH1mut胶质瘤的体内和临床研究提供了临床前证据,这可能最终改善患者的临床结果。




迄今为止,由于缺乏临床模型,IDH1mut胶质瘤的药物发现工作受到限制。原发性IDH1mut患者来源的肿瘤球体(PDTs)在体外培养具有挑战性,即使成功,IDH1突变也可能在细胞培养过程中丢失。因此,来源于IDH1mut肿瘤的PDT很少见,而且生长相对缓慢,很难获得足够的材料来进行需要大量细胞的培养。这对IDH1mut胶质瘤的药物筛选工作是一个重大挑战。鉴于治疗选择和研究工具有限,有必要开发合适的IDH1mut胶质瘤体外筛查平台,以实现在低细胞量的培养模型中筛选大量化合物。我们最近开发的小型化液滴微阵列(DMA)平台为高度小型化提供了解决方案。


DMA平台是一个小型化的芯片,有数百个纳米级液滴,液滴体积取决于被超疏水屏障包围的亲水点的大小。这些液滴可用于独立的2D或3D细胞培养实验,由于体积小,DMA可以大大减少实验所需的细胞、药物和试剂的消耗。


图1 高通量药物筛选和命中验证的工作流程


液滴微阵列芯片使用最少的试剂(200 nL培养基,每个点300个细胞)快速经济地筛选2208种FDA批准的药物。该测定在标准96孔板中使用MTT法进行验证。使用蛋白质印迹和质谱评估靶向和靶外效应。药物靶点分析与癌症基因组图谱(TCGA)和中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)数据库中的患者生存数据相关,以促进个性化临床治疗。






芯片前期制备过程




Drug library printing: 在接种细胞之前,先将不同的药物DMSO溶液以微阵列的形式分配在DMA芯片上,每个液滴2 nL的药物溶液,5重复。


Cell seeding: 将患者来源的肿瘤球(NCH1681/TS603)同样以微阵列的形式分配于DMA芯片上,每个液滴200 nL,包含300个细胞。(使用I.DOT


悬滴法培养三天进行后续的实验测试。

图2  NCH1681或TS603球体的


培养1、3、5和7天。接种的细胞数量为每滴300个细胞,斑点大小为1 mm×1 mm。


图3 球体图 NCH1681或TS603的直径随时间变化(n=50)。





总结



在这项工作中,作者提出一种新的药物筛选策略,在初始细胞量不足的情况下如何使用3D细胞培养筛选大量药物,前期细胞培养模型的制备至关重要。利用DMA平台培养细胞的方式和药物筛选的结果验证了该策略的可行性,为如何快捷、高效、降低成本地进行药物开发提供了思路。



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