在生物生产领域，单克隆性是至关重要的，它要求细胞来自单个细胞且具有遗传同质性。传统的单细胞克隆方法，如有限稀释法，是基于泊松统计概率来估计单克隆性的；这种方法存在诸多弊端，它不仅耗时、通量低，而且需要细胞扩增来确定理想的候选细胞。此外，由于有限稀释可能导致每个孔中有多个细胞，所以往往需要多轮克隆来提高单克隆性的概率[1-3]。
NanoCellect Biomedical, Inc.推出的WOLF G2流式细胞分选仪，它们能够筛选数百万个细胞，并根据多达11个参数对感兴趣的细胞进行特异性分选和单细胞分配，从而满足细胞系开发的需求。本文使用了一种常见的荧光参数—活力染料，来提高细胞的生长。DRAQ7就是一种用于检测细胞活力的远红色生物标志物，它可以与细胞膜受损细胞中的双链DNA（dsDNA）结合 [4,5]。利用配置有488nm和637nm双激光的WOLF G2来分选带有DRAQ7的GFP + HEK293细胞，可以完全排除死细胞，在进行单细胞克隆时最大化铺板密度和细胞的生长[6]。
鞘液和样品缓冲液由1xPBS、0.5% BSA、5mM EDTA和12.5mM HEPES组成。实验设置了多个对照组，包括未染色的HEK293T阴性对照、用DRAQ7染色的活：死（50:50）HEK293T对照以及GFP + HEK293对照。用于分选的样品中含有75%的HEK293T和25%的GFP + HEK293T细胞，并用DRAQ7染色，最终浓度为1.0x10⁵cells/mL。
在分析过程中，应用补偿来创建一个矩阵（图1）。将带有细胞门的散点图应用于FSC-H与FSC-width图以创建单线门。单线门应用于双变量图（DRAQ7 vs FITC）。
图1. 基于DRAQ7和GFP标记的细胞分选结果分布图
将细胞分选到预先填充有200 uL完整克隆培养基的三个96孔板中，同时准备一个采用有限稀释法（1.0细胞/孔）的96孔板作为对照。这些板在37°C、5% CO₂的环境中培养，并在第0天使用酶标仪的绿色荧光通道检测可能生长成菌落的GFP+细胞。在第7天和第14天，使用明场和绿色荧光通道确认菌落形成并确定细胞生长情况。而且，这个实验重复了三次，每次都使用不同的无菌WOLF分选盒和流体系统。
1、在总体生长情况上，使用配置637nm激光的WOLF G2对带有DRAQ7的GFP+ HEK293细胞进行单细胞分选以排除死细胞时，观察到平均总生长率为81±3.9%，相比有限稀释法的20±8.1%，提高了约4倍（图2）。
图2. 14天后HEK293 GFP的平均总生长量：与有限稀释法相比，使用WOLF G2用于单细胞集落时，观察到生长量增加了4倍。
2、在单克隆生长情况方面，在第0天、第7天和第14天对96孔培养板进行分析时，确认WOLF G2导致了74±2.9%的单克隆生长，与有限稀释法制备的板中20±7.6%相比，提高了3.75倍（图3）。
图3. 与有限稀释法相比，使用WOLF G2进行单细胞克隆时的平均单细胞沉积：与极限稀释相比，用于单细胞克隆的WOLF G2产生了3.75倍的孔，其中含有源自单个细胞的单个菌落。
3、单克隆性通过在第0天、第7天和第14天使用Celigo分析细胞，追溯确认检测到的颗粒实际上是细胞，并通过观察它们生长成菌落来验证单克隆性。同时，多天的测量也确保了含有菌落的孔确实来自单个细胞（图4）。
图4. 在第0天、第7天和第14天显示单细胞生长的代表性孔：在使用WOLF G2和N1进行单细胞分选时，第0、7和14天用于确定菌落是否来自沉积在孔中的单个细胞。注意细胞如何保持在相同的位置，并随着细胞的生长而增大。
4、总生长结果与我们之前使用WOLF在没有活性染料的情况下对GFP+ HEK293细胞进行分选的结果一致。先前研究的平均总生长为78±5.5%（图5）[7]。
图5. 与WOLF、WOLF G2和有限稀释法相比，HEK293 GFP的平均总产出量在范围内，无论使用哪种WOLF。由于能够产生更多的单细胞克隆，使用WOLF的单细胞分选优于限制稀释。
这项研究表明，WOLF G2与传统的有限稀释法等方法相比，能够确保更高的单克隆性。而且，WOLF G2还有多种激光配置可供选择，如488-405nm和488-561nm等，可用于各种遗传标记、常规染料和新兴化学物质，以满足细胞系的开发以及其他克隆或样品制备工作流程的需求。
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