案例应用丨C.BIRD™技术：加速HEK293细胞株生长与蛋白产量

CYTENA公司的 C.BIRD 微型生物反应器为细胞培养带来了新的可能。之前的研究已经表明它能提升悬浮型CHO细胞系的生长和蛋白生产，这次研究发现它对贴壁的 HEK293 细胞在96孔和24孔板培养中也有显著效果。

研究选用了表达单克隆抗体（mAb）的 HEK293 细胞系，在含有10%胎牛血清、青霉素-链霉素和100 μg/mL 潮霉素B的Minimum Essential Medium（MEM）中培养，培养环境为 37°C、5% CO₂。使用了标准的24孔板和96孔板，同时设置了传统静态培养和C.BIRD混合培养两种方式进行对比。细胞初始浓度分为低初始密度（1x10⁴ cells/cm²）和高初始密度（1x10⁵ cells/cm²）两组。

在 C.BIRD 混合培养组中，细胞先在静态条件下培养 24 小时，然后以50 秒/周期的混合速率在C.BIRD系统中连续混合培养。在指定时间，收集细胞培养上清液测定蛋白产量，用 0.25% 胰蛋白酶消化收集细胞，用TC20自动细胞计数器测量总细胞密度、活细胞密度和细胞活力，蛋白产量通过 IgG（Total）Human Uncoated ELISA Kit 测量，并计算蛋白倍数变化，进行多重未配对t检验。

对比实验设计如图1所示。采用静态培养法和C.BIRD培养法测定表达HEK293细胞的总细胞密度、活细胞密度和蛋白产量。

图1. 实验设计示意图

结果显示，在96孔板测试中，第8天C.BIRD培养组的平均总细胞密度和活细胞密度分别达到3.29和 3.12x10⁶ cells/cm²，而静态培养组仅为1.40和1.29x10⁶ cells/cm²（图2A,2B），且两组细胞的活力到第8天均保持在90%以上（图2C）。测量天数内，C.BIRD 培养组的平均蛋白产量是静态培养组的2倍多（图2D）。

24 孔板测试结果类似，第8天C.BIRD组的总细胞密度和活细胞密度平均值分别为3.01和2.83×10⁵/cm²，几乎是静态培养组的3倍（图2E,2F），两组细胞存活率均维持在90%以上，直至第8天（图2G），蛋白产量也比静态培养方法提高了2倍（图2H）。

静态培养法和C.BIRD培养法在96孔板和24孔板上的细胞融合度如图3所示。两组的培养液中几乎都没有发现漂浮的死细胞。然而，在显微镜下观察两组细胞密度的差异是明显的。C.BIRD培养组细胞比静态培养组细胞更致密。这一结果与图2所示的细胞密度量化有关。

图2. A-D)低初始密度试验96孔板培养条件下细胞总密度、活细胞密度、细胞活力和蛋白产量。E-H)低初始密度试验时24孔板培养条件下的细胞总密度、活细胞密度、细胞活力和蛋白产量。数据以mean±SD表示。

图3. 低初始密度培养条件下表达HEK293细胞的单抗在96孔板和24孔板的亮场显微镜图像。在指定时间观察静态组和C.BIRD培养组。比例尺= 1mm。

在高初始密度试验中，细胞播种密度为1x10⁵个/cm²。结果与低初始密度试验的趋势一致。在96孔板测试中，第3-5天，C.BIRD培养组的平均总细胞密度和活细胞密度分别达到3.28x10⁶ cells/cm²和3.16x10⁶ cells/cm²，是静态培养组的2.2 倍（图4A,4B），细胞活力到第5天均保持在90%以上（图4C），蛋白产量在第5天将近是静态培养组的4倍（图4D）。24 孔板测试中，C.BIRD培养方法也提高了总细胞密度和活细胞密度（图4E,4F），每组细胞活力到第5天保持在90%以上（图4G），第3-5天C.BIRD培养组的蛋白产量显著高于静态培养组（图4H）。

高初始密度试验的细胞融合性结果与低初始密度试验的结果相似。镜下观察，两组培养液中均未见漂浮死细胞。此外，C.BIRD培养组的细胞比静态培养组更致密（图5）。

图4. A-D)高初始密度试验96孔板培养条件下细胞总密度、活细胞密度、细胞活力和蛋白产量。E-H)高初始密度试验时24孔板培养条件下的细胞总密度、活细胞密度、细胞活力和蛋白产量。数据以mean±SD表示。

图5. 高初始密度培养条件下表达HEK293细胞的单抗在96孔板和24孔板的亮场显微镜图像。在指定时间观察静态组和C.BIRD培养组。比例尺= 1mm。

C.BIRD 混合培养显著提高了 HEK293 细胞系在96孔和24孔板中的细胞密度和蛋白产量，能够缩短获得足够细胞数量和蛋白分泌所需的培养时间，这对生物制品生产、细胞疗法和基因疗法等使用HEK293细胞系及其衍生物的过程具有潜在的加速作用。

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